產品中心
PRODUCT CENTER
快速抗體純化磁珠
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貨號 |
產品名稱 |
產品規格 |
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EA101 |
BcMag ? 快速抗體純化試劑盒 |
2 ml （純化高達10mg IgG） |
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EA102 |
BcMag ? 快速抗體純化試劑盒 |
10 ml （純化高達50mg IgG） |
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運輸條件: 常溫運輸
儲存條件: 在4oC儲存試劑盒。
原理
可以使用以4-巰基-乙基吡啶為配體的疏水電荷誘導色譜法從各種生物物質中分離抗體（圖1）。結合基于溫和的疏水結合方式，并且在接近生理的情況下完成，不需要使用鹽。當pH降低時，配體和抗體在溫和的酸性環境（pH 4.0-4.5）下獲得凈正電荷。
與更傳統的抗體純化方法（如蛋白A或離子交換）相比，HCIC具有幾個工藝優勢：
? 樣品制備時減少對樣品的損傷，因為磁珠可以在沒有離子強度或極端pH調節的情況下使用。
? 對樣品中目標產物濃度低的現象不需要預濃縮，因為即使原樣品稀釋至每毫升40ug抗體，也可以實現有效捕獲。
? 用稀釋緩沖液進行溫和的pH控制洗脫可降低在較低pH下抗體聚集的可能性，并避免需要IgG脫鹽或滲濾。
磁珠產品與傳統色譜法如純化柱、瓊脂糖或非磁性樹脂相比具有顯著優勢。基于磁珠的特性可以在約20分鐘內快速高產率處理96個樣品，不同IgG種類抗體純化產物獲得超過80％純度和超過90％回收率。當使用基于色譜柱的技術實驗時，在科學研究實驗室處理多個樣品時，可能需要大量的手動移液操作。這種移液操作會造成實驗和人之間目標生物分子產量的差異。實驗人員和學生可能需要大量的培訓和實踐才能產生恒定的蛋白質產量。而且磁珠具有許多優點，例如它們易于使用，快速的實驗方案，適用性以及高通量自動化和小型化處理的便利性等。
工作流程（圖2）
使用色譜法分離復雜混合物中存在的抗體涉及結合珠子的抗體。結合后，洗滌磁珠以除去非抗體蛋白。最后，從磁珠上洗脫抗體。
功能和優點
? 高效 - 回收率超過90％，純度超過85％。
? 快速純化 - 一步法手動或一步法高通量操作。
? 便捷 -無需使用純化柱、過濾器，且不需要繁瑣的移液或離心操作。
? 不含胺基緩沖液 - 無需進行去除或中和操作。
? 結合力強 - 適用于對蛋白A或蛋白G結合能力較差的IgG亞類。
? 溫和 - 無需苛刻的抗體洗脫條件，有助于保持IgG的活性。
? 可再生 - 磁珠可重復使用，可進行多達3次純化。
操作協議
提示：
? 以下方案是從血清中純化抗體的例子。
? 磁珠和樣品體積可以合理放大（或縮小）。
緩沖液：
? 2x結合/洗滌緩沖液：25 mM磷酸鈉，pH 8.5
? 洗脫緩沖液：20 mM乙酸鈉，pH 4.0100 mM NaCl
? 再生緩沖液：35 mM磷酸鈉；30%正丙醇，pH 8.5
儀器要求
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Item |
Source |
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磁力分離器
**根據樣品體積，用戶可以選擇以下磁力分離器之一 |
l BcMag? separator-2 適用于兩個單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag? separator-6 適用于六個單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag? separator-24 適用于24個單獨的1.5-2.0 ml離心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag? separator-50 適用于1個單獨的50毫升離心管，1個單獨的15毫升離心管, 以及4個 1.5毫升 離心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分離器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分離器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可調單通道和多通道移液器 |
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擺斗離心機 |
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如果使用96孔PCR板/管，則需要添加項目 |
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渦懸混合器 **用戶還可以使用其他型號的渦懸混合器。但是，時間和速度應進行優化，并且混合器應滿足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf? MixMate? |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24?×?1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 離心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，確保PCR管或PCR板錐形部分底部的井徑必須≥2.5毫米。 |
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如果使用96孔微孔板需要添加的設備 |
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Fisher Scientific? Microplate Advanced Vortex Mixers |
Fisher, Cat#:02-216-101 |
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OHAUS Microplate Vortex Mixers |
OHAUS, Cat#:30392160 |
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渦懸混合器 **用戶還可以使用其他型號的渦懸混合器。但是，時間和速度應進行優化，并且混合器應滿足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉速 ≥800 rpm |
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平底透明的非結合型分析微孔板 |
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實驗步驟
重要提示：
? 以下方案針對3μl血清樣品的高效純化進行的優化。如果進行其他反應，則可能需要進行程序優化。
? 在使用前，搖晃或渦旋混合試劑瓶，完全重懸磁珠。
? 不要讓磁珠靜置超過兩分鐘。
A. 樣品制備
1. 用等體積的2x結合/洗滌緩沖液稀釋全血清并充分混合。
B. 磁珠制備
1. 搖動試劑瓶以完全重懸磁珠。
2. 將所需量的磁珠轉移到離心管中（注意：1ml的 BcMag? 快速抗體純化磁珠，建議用于0.5-1毫升全血清純化使用。可以相應地縮放體積。血清中的IgG水平通常為10-15mg/ml）。將試管放在磁性支架上1-3分鐘，直到上清液變清。在管保持在支架上的同時除去上清液。
3. 取出試管，用10倍磁珠體積的1x結合/洗滌緩沖液重懸磁珠。
C. 樣品結合
1. 將步驟B.4中洗滌過的磁珠添加到步驟A1中稀釋的樣品中。將磁珠完全重懸，并在室溫下放置10-30分鐘，并進行顛倒旋轉。
2. 將試管放在磁性支架上1-3分鐘。在管保持在支架上的同時除去上清液。從支架上取下試管，用10倍磁珠體積的1x結合/洗滌緩沖液洗滌磁珠。
3. 重復步驟3五次
D. IgG洗脫
1. 從支架上取下試管，用10倍磁珠體積的洗脫緩沖液重懸磁珠以洗脫IgG。將試管放在磁性支架上1-3分鐘。在管保持在支架上的同時移走上清液。
小型高通量凈化
1. 將50μl磁珠（步驟B4）轉移到96孔PCR板或96孔微孔板或0.2ml PCR管的新孔中，并將A1中稀釋的血清吸取20μl加入。
2. 通過緩慢上下移液25次（一分鐘）或通過渦旋混合器以2000 rpm混合5分鐘，將磁珠與樣品混合。
3. 將樣品板/管放在磁分離板上30秒或直到溶液澄清。
4. 丟棄上清液，并使用磁力架用100μl 1x結合/洗滌緩沖液洗滌磁珠三次。
5. 加入50μl洗脫緩沖液，通過緩慢上下移液25次（一分鐘）或以2000 rpm的速度渦旋混合器5分鐘來洗脫抗體。
6. 將樣品板/管放在磁分離板上30秒或直到溶液澄清。
7. 將上清液轉移到干凈的板/管中，同時樣品板保持在磁分離板上。該樣本已準備好用于下游應用。
附加信息：
磁珠再生
1. 如果必須再生磁珠，則添加10ml 35 mM磷酸鈉；30%正丙醇，pH 8.5緩沖液，用于1 ml磁珠再生，并通過緩慢上下移液25次將磁珠與樣品混合。將樣品板/管放在磁分離板上30秒或直到溶液澄清。丟棄上清液。
2. 重復步驟1五次。
3. 用10倍磁珠體積的1x結合/洗滌緩沖液洗滌磁珠三次
4. 將磁珠重懸于1x結合/洗滌緩沖液中，并保存在4°C。磁珠可以再生三次而不會失去實質性的選擇性。
故障排除
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問題 |
可能的原因 |
建議 |
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純化抗體的產量太低或檢測不到 |
沒有抗體的樣品 |
? 通過使用其他方法（例如ELISA或同種型試劑盒）確保樣品含有IgG。 |
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感興趣的抗體不與磁珠結合 |
? 確保樣品的pH值在8.5之間。 |
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觀察染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上存在多條帶 |
磁珠和樣品的比例沒有得到優化。 |
? 用1x biding/wash緩沖液透析樣品。 ? 優化珠子和樣品的比例 |
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純化了大量抗體。然而，沒有發現感興趣的抗體。 |
感興趣的抗體濃度低。 |
? 利用活性親和磁珠和特異性抗原純化抗體。 |
